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CHAGAS.com.AR
CHAGAS: Perspectiva del uso de la serología (Ag naturales y otros) en la evaluación de la eficacia del tratamiento etiológico
Alejandro O. Luquetti, Anis Rassi
Laboratório de
Chagas, Departamento de DMIPP, Instituto
de Patologia Tropical e Saúde Pública,
Hospital das Clínicas y Facultad de
Medicina de la Universidad Federal de
Goiás,
Goiânia, Brasil.
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Resumen
Dentro de las características esenciales
de la infección por el Trypanosoma
cruzi se encuentra una potente
respuesta inmune, que se constata en el
laboratório por medio de la búsqueda de
anticuerpos contra el parásito. Esta es
prácticamente la única característica
constante, que se encuentra en todos los
infectados. Por ese motivo, es la mejor
herramienta para evaluar la eficácia del
tratamiento tripanocida.
Haremos referencia en la exposición que
sigue, a diferencias principalmente en
el tiempo necesário para constatar un
efecto terapéutico, que van de
observaciones de pocos meses en los
congénitos tratados, a más de 20 años de
seguimiento en aquellos tratados en la
fase crónica tardía. Se aclara
que la concentración de anticuerpos es
estable en la población infectada y no
tratada.
Se hace referencia a la preferencia, en
la actualidad, por el uso de los tests
convencionales, con antígenos no
purificados, en relación a las nuevas
tecnologias, y los motivos de esa
elección.
Se aborda la necesidad de preservar
alícuotas de los sueros y de como
hacerlo, para una correcta
monitorización. Por último, se
discute el significado de la serologia
oscilante que ocurre en algunos
tratados, después de transcurridos
períodos considerables de tiempo.
Introducción
La confirmación laboratorial de la
infección por el Trypanosoma cruzi
durante la fase crónica de la
tripanosomiasis americana se hace, de
manera indiscutible, por la presencia de
anticuerpos contra el parásito. Por lo
tanto, nada más lógico que, para
certificar la cura después del
tratamiento específico, sea exigida la
desaparición de aquellos anticuerpos
cuya existencia fué motivada por la
presencia del parasito. Como dice
Cançado (2000), una vez desaparecida la
causa, cesa el efecto.
Por lo antedicho, el monitoreo de todo indivíduo tratado, debe hacerse por medio de la serologia, con el objetivo de medir la concentración de los anticuerpos. Si después de cierto tiempo, que después discutiremos, los niveles de anticuerpos permanecen como antes, no hubo cura, el parásito no há desaparecido y se deberá tentar otra droga u otros esquemas terapéuticos.
Por el contrário, si
pasado el tiempo razonable de
observación [que en la fase crónica de
larga duración (adultos) puede ser de
décadas] no hay más anticuerpos o se
encuentran en títulos muy bajos en
relación al comienzo, podremos decir,
basados en la serologia, que el paciente
no tiene más parásitos y se ha curado, o
está en camino de la demostración de
cura, respectivamente.
Estos conceptos, aparentemente simples,
son más difíciles de comprender en la
práctica corriente. Trataremos, de
ofrecer más elementos y explicaciones en
el manejo del dia-a-dia del paciente
tratado.
La serologia en el infectado no tratado
La premisa esencial para comprender la
importancia del seguimiento serológico,
es conocer el comportamiento de la
respuesta inmune humoral en el chagásico
no tratado. Existe bastante confusión en
la literatura cuanto al valor de la
serologia y a la constancia de sus
resultados en el infectado crónico.
Muchas dudas surgieron en la época en donde sólo existía la reacción de fijación de complemento (RFC) como método de inferir la concentración de anticuerpos. Sólo en 1976, después del excelente trabajo de normatización de Almeida y Fife (OPS, 1976) se tuvo una posición internacional sobre que antígenos utilizar en la RFC y sobre como proceder para la ejecución de esta técnica de manera confiable.
Pero ya en esa época se estaban utilizando, con exito, la hemaglutinación indirecta (HAI) descrita por grupos chilenos y argentinos y la inmunofluorescencia indirecta (IFI) por Camargo, en Brasil. Un año antes se había hecho la primera publicación del test inmunoenzimático (ELISA) por Voller y col.(1975).
Estas tres últimas demostraron, con el pasar del tiempo, que tenían ventajas indiscutibles sobre la RFC: eran más reproducibles, pero principalmente más rápidas, por utilizar menos reactivos y por lo tanto menor posibilidad de errores. Por otra parte, no existían más resultados anticomplementares, de observación relativamente frecuente en la RFC.
Pero, en esa época aún existían discrepancias entre los diferentes laboratorios trabajando con los mismos sueros, dependientes de lotes diversos y, principalmente, de su producción, hecha en cada centro. Las empresas de reactivos rápidamente percibieron que, dada la gran prevalencia de la infección en toda América Latina y la necesidad de los Bancos de Sangre de ofrecer un producto confiable sin, entre otros agentes, el T.cruzi, la producción de conjuntos diagnósticos (Kits) sería oportuna y rentable. Rapidamente, várias empresas en Argentina, Brasil, Chile y últimamente Paraguay y Estados Unidos comenzaron a producir Kits, para HAI, para IFI y para ELISA, en esa orden. A pesar de que existen Kits de calidad diversa, siendo que algunos dejan a desear, la propia comunidad científica, por medio de evaluaciones continuadas, obligó a aquellas empresas con productos de poca calidad, a modificarlos. Como dice Yanovsky (comunicación personal, 1985) después de la "democratización" de la serologia, se han conseguido obtener resultados confiables. Hoy en dia, con la mayoría de los Kits que existen en el mercado, podemos decir que la serologia es una herramienta precisa, desde que ejecutada por personal bien entrenado. Tanto en Argentina como en el Brasil, los programas de Chagas de los respectivos gobiernos, se han interesado en el tema y ofrecen cursos y educación continuada para técnicos de diferentes niveles. También Colombia há impreso manuales en este sentido.
Una vez establecido que tenemos reactivos y personal que permiten dar gran confiabilidad a un resultado serológico en la infección por el T. cruzi, cabe saber como es la respuesta individual de cada chagásico.
Motivados por este tema, nosotros hemos buscado en nuestra seroteca, iniciada en la década de 70, y que cuenta actualmente con más de 20.000 sueros, muestras de pacientes que aún se encuentran vivos, a los cuales hemos convocado para nuevas colectas de sangre. Con un otro grupo, comenzamos a colectar suero, primero mensualmente, y después cada dos, tres, o más meses, de 45 chagásicos, de diferentes edades, sexo y formas clínicas, todos en la fase crónica. Hemos separado aquellas muestras anteriores, algunas con más de 20 años de diferencia con el suero actual, y comparado sus concentraciones de anticuerpos por las tres técnicas: HAI, IFI y ELISA. Los resultados han demostrado que no hay diferencia significativa, mes a mes o año a año, entre los diferentes sueros del mismo paciente. La serologia, de esta manera, se torna un arma de gran valor para detectar intervenciones en determinado paciente; si no hubo ningún efecto de la intervención, los títulos de anticuerpos deberán ser similares, o sea mas menos uno o dos títulos, que es la variación permitida por las técnicas utilizadas. Por otro lado, si después de la intervención (tratamiento etiológico), en plazos variables, observamos títulos cada vez menores en cada test realizado, algo ocurrió, que no es lo esperado: la intervención modificó la concentración de anticuerpos, y podemos deducir que los parásitos no existen más, pues la presencia de ellos, por pocos que fuesen, seria suficiente para mantener la respuesta inmune en la plenitud de su síntesis. En pocas palabras: há cesado la causa, y el efecto, a los pocos, deja de existir.
La serologia después del tratamiento
En este momento cabe diferenciar a quien
estamos tratando, o, más precisamente,
en que fase de la enfermedad estamos
actuando. Para efectos de evaluación del
tratamiento en la infección por el
T.cruzi, caben 4 grupos, claramente
definidos cuanto a la respuesta
terapéutica y a la consiguiente
evaluación de la eficácia del
tratamiento:
Posteriormente, aquellos abnegados investigadores que persistieron en sus estudios en cada paciente, comenzaron a darse cuenta que en algunos del grupo con xenodiagnóstico negativo, la serologia comenzaba a quedar de difícil interpretación: los títulos bajaban, a veces negativaban en un control y presentaban un aumento ligero en control posterior: se cuñó el término de serologia oscilante, significando que, después de cierto tiempo de observación, en general después de los 10-15 años, los resultados serológicos obtenidos eran variables y de difícil interpretación, hecho que no se veía al início del follow up, y tampoco se veía en el grupo de xenodiagnóstico positivo, que mantenía su serologia claramente positiva, como siempre había sido. Al continuar observando estos pacientes en seguimientos anuales o en plazos menores, la mayoria de ellos alcanzaba la negatividad serológica en el plazo de 5 a 10 años más, o sea, era posible obtener la negativación después de 20 o más años de seguimiento. La proporción de chagásicos en la fase crónica de larga duración que han sido tratados por uno de nosotros (AR) y que ha negativado su serologia después de esos plazos, está en este momento, alrededor del 25%. Como tenemos otros que están en la fase anterior, de serologia oscilante, esperamos que este porcentaje suba en el futuro.
En suma, para comprobar la cura, que significa la negativación serológica, es necesário esperar por plazos variables, que dependen en particular del tiempo en que el infectado estuvo en contacto con el parásito: en la fase aguda, hasta 5 años, en la fase crónica reciente, con convívio con el parasito por alrededor de 10 años, un plazo un poco mayor (5-10 años), y, en los crónicos, con convivencia de más de 20 años, un tiempo adicional, similar. Así, lo que los investigadores publicaban en la época, de que en la fase crónica el tratamiento no conseguia negativar la serologia, era cierto para el tiempo de observación, relativamente corto en términos de la historia natural de la infección chagásica. Pero, al final, fué solamente una cuestión de follow up: si observamos el paciente por el tiempo necesário, podremos observar la negativación de la serología.
Cual es el lugar de los tests
parasitológicos?
Debemos hacer un paréntesis en este
momento, y aclarar el valor y alcance de
los exámenes parasitológicos en
pacientes tratados, como herramienta en
el control de cura. Como podrá ser
encontrado en otra conferencia de
nuestro grupo [ver "Critérios de cura",
por Rassi y col.], creemos que son de
gran utilidad, cuando realizados, si
fornecen un resultado positivo, pues son
la prueba feaciente del fracaso
terapéutico. El problema es que hoy en
dia, en la práctica médica, la situación
es diferente de hace una o dos décadas.
Hoy se sabe que el tratamiento es
efectivo en una parte de los infectados,
y por lo tanto, hay mucho más médicos
interesados por instituir tratamiento
etiologico a sus pacientes que
antiguamente. Por otro lado, el
chagásico en particular, ahora viviendo
en las ciudades, es con frecuencia
esclarecido, y sabe que existe
tratamiento y pregunta a su médico sobre
el mismo. Por lo tanto, la demanda por
tratamiento há aumentado. En razón
inversa, ningún examen parasitológico se
encuentra disponible en el mercado, o
sea, no es posibile hacer
xenodiagnóstico o hemocultivo o PCR en
la práctica médica. El médico puede
sentirse limitado si cree que es
imprescindible un examen parasitológico
para efectuar el tratamiento. Por otro
lado, sabemos que el examen sólo tiene
valor absoluto si positivo, y, por lo
tanto, no limita de ninguna manera al
médico para la institución de
tratamiento, que puede ser controlado
apenas con serología, que, claro,
demorará mas tienpo. Si hubiese
facilidades para exámenes
parasitológicos, mucho mejor, pero como
decimos, esto no es posible en la
actualidad. Brevemente, en trabajos de
investigación, el xenodiagnóstico se
sigue empleando, en mayor escala, en
Santiago (Chile) por el grupo de
Schenone, en Buenos Aires (Argentina)
por el Instituto Mario Fatala Chabén, y
en el Brasil por tres grupos en la
actualidad: los de Fragata y col. del
Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia,
São Paulo, Castro y col. de la
Universidade de Brasília y Rassi y col.
de la Universidade Federal de Goiás. El
hemocultivo se practica principalmente
en Córdoba (Argentina), y en el Brasil:
Belo Horizonte y recientemente en
Goiânia, y el PCR en la Fiocruz (Fernandes
y col., Rio de Janeiro) y Universidade
Federal de Minas Gerais (Chiari y col.).
Esta última técnica también se efectúa
en la SENEPA, Asunción Paraguay (Russomando
y col.) y en otros centros aislados de
Argentina y Bolivia, como seguimiento de
tratados.
¿Qué tests serológicos utilizar?
Para efectuar un correcto seguimiento
serológico, interesa fijar los plazos
ideales entre cada toma de muestras,
conservar las muestras de suero (o
plasma) por tiempo indefinido y elegir
los tests a ser aplicados.
1. Intervalos de
toma de muestras de sangre:
Depende de la fase de la enfermedad: si
congénito o en la fase aguda, se puede
solicitar examen serológico a cada 6
meses, de acuerdo a la disponibilidad
del paciente. Debemos recordar que
Chagas agudo aún es una enfermedad
predominantemente rural, por lo que el
tratado deberá efectuar un viaje, a
veces de centenas de Km, para recoger
una muestra de sangre.
En los otros casos, de fase crónica, una
periodicidad anual es satisfactória.
2. Conservación de
muestras de suero.
La táctica que adoptamos para conservar
los sueros con el objetivo de comparar
los resultados en el seguimiento se ha
mostrado adecuada, teniendo en cuenta
que es necesário guardar las muestras
por muchos años. Eso es debido a la
posibilidad de existir variaciones de
lote o de fabricante de los reactivos en
el curso de 20 o más años de
seguimiento, lo que significa la
necesidad de poseer muestras de suero
inicial y posteriores, para poder
comparar eventuales disminuciones de
título, en el seguimiento año a año.
Así, se efectúan tests en paralelo, con
el suero inicial y los posteriores, el
mismo día y sometiéndolos a las mismas
técnicas. Esto permite hacer la
comparación de la actividad inicial
hasta la final y deducir si há habido un
cambio en la titulación. Otra ventaja de
esta táctica es que, en la eventualidad
de aparecer nuevos métodos serológicos,
podremos aplicarlos con las alícuotas
conservadas; procediendo de esta manera
conseguimos aplicar hoy en día, las
nuevas tecnologias con recombinantes y
citometría de flujo, aparte de la HAI
IFI y ELISA, con sueros obtenidos en la
época en que apenas se realizaban la
fijación de complemento y la IFI. A
pesar de parecer complejo mantener un
grupo de sueros conservados por muchos
años, hemos encontrado gran facilidad
por el empleo de glicerina como descrito
por Camargo y col. Se mezcla volumen a
volumen, una parte de suero y una parte
de glicerina (por ejemplo, 3ml de suero
más 3 ml de glicerina pura (p.a ) que se
puede obtener en el comercio. La
glicerina conserva el suero por más de
20 años, sin necesidad de congelación,
aunque es recomendable mantener los
frascos en la heladera o en el
congelador.
Elección de los tests serológicos a
utilizar
Como ya expuesto, existen hoy en dia
tres técnicas serológicas que atienden a
las necesidades del control serológico
pós-terapéutico: la HAI, IFI y el test
inmunoenzimático de ELISA. Son los
llamados tests convencionales,
utilizados ampliamente en todo el mundo,
facilmente obtenibles en el mercado, y
con los cuales hay experiencia
acumulada, en todos los países, por más
de dos décadas. O sea, sus resultados
son indiscutibles y reproducibles. Si
bien hay excepciones, es posible hacer
un diagnóstico correcto en más del 98%
de los infectados. Cuando existen
reacciones dudosas (en el 2%) debemos
recorrer a un laboratório especializado.
Es evidente que no vamos a intentar
tratar a un caso con serologia dudosa,
pues ni tenemos la seguridad de que sea
chagásico. Como el tratamiento en el
infectado crónico no se hace de rutina,
y está sujeto a reacciones colaterales,
es deseable tener la seguridad del
diagnóstico serológico, lo que se
obtiene utilizando por lo menos dos
tests serológicos de princípios
diferentes, o sea, ELISA y HAI, por
ejemplo. En el seguimiento, se
recomienda utilizar los mismos tests
inicialmente empleados, para permitir la
comparación de resultados.
Los infectados chagásicos por lo general tienen títulos elevados de anticuerpos, del orden de 1/640 o más en la IFI y de 1/128 o más en la HAI. Con ELISA en general se obtienen densidades ópticas del doble del punto de corte o más. Un 10 a 15% de los infectados presentan, antes del tratamiento, títulos más bajos, de 1/160 en la IFI, 1/16 en la HAI y ELISA com D.O entre 1,5 y 2,0 veces la DO del punto de corte. En ellos es más importante aún guardar la primer muestra de suero, para poder comparar, año a año las modificaciones en la concentración de anticuerpos. En estos casos, si al inicio la IFI era de 1/160, un resultado de 1/80, que sería bajo en otras circunstancias, no significa alteración ninguna en ese paciente en particular, y, para hablar de caída de títulos, el mismo debe presentar en el futuro lejano una IFI de 1/20 o menor. Ocasionalmente, la HAI puede ser negativa, antes del tratamiento. En este caso, el seguimiento debe ser con IFI y ELISA.
¿Cuál es el lugar de nuevos tests
serológicos en el control de cura?
Mientras los tests convencionales ya
descritos, usan antígenos no
purificados, o sea, antígenos brutos,
existen hoy en dia una série de
antígenos "no convencionales", que
emplean, ya sea antígenos purificados,
recombinantes, péptidos sintéticos u
outro tipo de técnica. Para todos ellos
la experiencia es bastante limitada,
mucho más aún en el control de cura, o
sea en la evaluación de la eficácia del
tratamiento etiológico. A pesar de
existir algunas publicaciones con
resultados al respecto, no hay
comprobación por la comunidad científica
internacional, como para recomendar su
uso indiscriminado. Digamos que están
aún en etapa de investigación, y se
espera su aprobación por otros grupos en
países diferentes de aquellos en que
fueron descritos, para su aprobación.
Hemos trabajado con algunos de ellos y en nuestra experiencia, son aún impracticables, sea porque están comercializados pero no permiten la titulación, o sea, el resultado es positivo o negativo, sea porque no se venden aún, sea porque necesitan de condicones técnicas inaccesibles para la mayoria de los laboratórios, o por otras razones.
a) FACS-scan:
Aparentemente con buenos resultados,
sólo se utiliza en la Fiocruz, Belo
Horizonte. Fuera de precisar de un
FACS-scan es necesario tener una fuente
de tripomastigotas, posible apenas en
laboratorios de investigación. A
propósito, la lisis mediada por
complemento há sido substituida por este
nuevo test.
b) Antígenos purificados: de los
utilizados en pacientes tratados, merece
destaque el A&T descrito por Almeida y
Travassos, usado en el trabajo ya citado
de Andrade y col., en el tratamiento de
fase crónica reciente, con resultados
aparentemente muy buenos. No se
encuentra comercializado, necesita de un
quimioluminómetro de placas,
indisponible en practicamente todos los
laboratórios de rutina, y , sólo
utilizado por el grupo que lo há
descrito, por lo tanto, inaplicable.
c) Recombinantes y/o péptidos
sintéticos: no nos referiremos a los
no comercializados, por la imposibilidad
de su adquisición. Dentro de los
comercializados, existen dos, el PaGIA (Diamed)
que usa polímeros sensibilizados con
tres peptídeos, de gran utilidad en el
diagnóstico, pero, al no ser
cuantitativo, tiene poco uso en el
follow up. Lo mismo para el Stat Pack (Chembio),
ya comercializado, test rápido, de buen
desempeño para el diagnóstico, pero
también apenas qualitativo. En forma
similar, el reactivo de Orgenics (Immunocomb),
de excelente desempeño, pero apenas
cualitativo, así como el Innolia: de
precio elevado (20U$S por test) con
varias bandas al igual que el de Gador
(Argentina), todos cualitativos.
Recientemente se ha comercializado el test de TESA [Umezawa y col.] pero no hay experiencia acumulada suficiente para recomendar su empleo en tratados.
Por lo expuesto, no se dispone de un test no convencional que pueda substituir, con suceso, a los convencionales, por lo que éstos son los preferidos, por el momento, hasta que los investigadores en la academia, traigan subsídios suficientes para recomendar el uso de alguno de los anteriormente comentados, desde que ya comercializado.
El significado de resultados de
serologia oscilante
Como aclarábamos anteriormente, después
de algunos años en que se mantienen los
títulos originales de anticuerpos,
algunos de los infectados tratados
comienzan a presentar una disminución de
sus títulos, que puede inclusive
negativar transitoriamente. Como ejemplo
característico, un infectado que fué
tratado en 1980, en donde presentaba la
IFI con título de 1/1280, la HAI de
1/512 y la ELISA de 2,5 veces el valor
del cut off, se ha mantenido en esos
títulos hasta 1990. En 1991, su IFI es
de 1/320, HAI 1/128 y ELISA 1,5 veces el
cut-off. En 1995 IFI de 1/80-1/160, HAI
1/16 y ELISA 1,4 veces el cut-off.
Durante los tres años siguientes,
mantiene esos títulos com ciertas
variaciones. En 1999 hay una nueva
inflexión en las curvas, con IFI
1/20-1/40, HAI 1/8-1/4 y ELISA1,0 a 1,2
del cut-off, ya iniciando el período de
negativación, Ocasionalmente la IFI sube
1/80 o la HAI 1/16. Aunque del punto de
vista teórico, sólo podemos pensar en
cura a partir de 1999, en este paciente,
las evidencias indican que ya en 1991,
estaba iniciando el "camino" para
demostración de cura. Creemos que en el
futuro, podremos tener la seguridad de
que todo tratado, cuando llega a la fase
de serologia oscilante, ya está en
proceso de demostración de cura.
Conclusiones
La determinación de la concentración de
anticuerpos es una herramienta de
utilidad impar en el seguimiento a largo
plazo de los infectados sometidos a
tratamiento etiológico. Deben ser
utilizados los tests serológicos
convencionales, y determinada la cura
cuando los mismos fornezcan resultados
negativos, demostrando la conversión
serológica, única herramienta a
confirmar la destrucción total de los
parásitos, que sucedió con frecuencia
algunos lustros antes. La búsqueda de
una herramienta que nos fornezca
resultados más precoces há sido motivo
de investigación por parte de la
academia que, todavía no há conseguido
suceso, como há sucedido en otras áreas
de esta enfermedad. Cítese como ejemplo
los marcadores de forma clínica que, a
pesar de buscados, tampoco han sido
encontrados. Estamos confiantes de que
los esfuerzos continuados de los
investigadores arrojarán en breve más
luces sobre este y otros tópicos de la
enfermedad de Chagas.
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